大环内酯类抗生素对大鼠肝移植后缺血再灌注损(3) -电力系统保护与控制杂志社投稿

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大环内酯类抗生素对大鼠肝移植后缺血再灌注损(3)

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摘要：

1.4.5 细胞凋亡检测移植后72 h的肝组织(n=10)的石蜡切片行常规脱蜡和复水后，采用TUNEL试剂盒(#C1086，碧云天，上海)进行检测。将肝切片与20 mg/L蛋白酶K溶液在室温下孵育10 min后，PBS洗3遍，37℃下孵育用TUNEL标记试剂1 h后，滴加DAB显示液孵育15 min，自来水冲洗后；常规脱水和中性树脂封固。显微镜下任选6个视野拍照，通过Image J软件对Ki-67阳性细胞进行计数。

1.4.6 蛋白质免疫印迹测定移植后72 h的肝组织(n=10)经匀浆后，经RIPA(#P0013C，碧云天，上海)提取蛋白。通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(#P0012S，碧云天，上海)测定蛋白浓度。蛋白经SDS-PAGE电泳后，将蛋白电转至PVDF膜，PVDF膜经封闭后，室温分别孵育一抗[1∶1 000稀释的cleaved caspase-3 抗体(#9654，Cell Signaling Technology，美国)和caspase-3(#9662，Cell Signaling Technology，美国)]1.5 h，TBST洗膜3次后，室温孵育 1 ∶2 000 稀释的二抗(HRP 标记的IgG，#7076，Cell Signaling Technology，美国)45 min，TBST洗膜3次后，利用增强的ECL化学发光试剂盒(#P0018AS，碧云天，上海)对目的条带显影，以β-actin(#AF0003，碧云天，上海)为内参，采用AlphaView软件测量目的条带的吸光度。

1.4.7 酶联免疫吸附测定移植后72 h的肝组织(n=10)样品中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平分别采用相应的ELISA试剂盒(#R600B；#RTA00；#RLB00；R&D Systems，美国)按照试剂盒说明书进行测定。待反应结束后，使用酶标仪测450 nm处的吸光度。

按照制作的标准曲线样品中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平并标准化为肝组织匀浆中的总蛋白，并表示为白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的相对值。

1.4.8 Kuffer 细胞计数用CD68免疫荧光染色评估移植后72 h肝组织(n=10)的石蜡切片中肝组织Kuffer细胞数。肝组织石蜡切片行常规脱蜡和复水后，滴加1∶200的CD68抗体(#ab，Abcam，美国)室温孵育1 h。PBS洗3遍后，室温避光孵育1∶200的Dylight 488标记IgG(#072-03- 18-06，KPL，美国)1 h。将DAPI染核5 min。荧光显微镜下随机拍摄6个视野，计数6个视野中的Kuffer细胞(CD68阳性)数，取平均值，表示为每个视野的细胞数。

1.5 主要观察指标①连续7 d观察各组大鼠生存率；②术后48，72 h血清AST和ALT活性；③术后72 h肝组织形态、肝组织Ki-67和cleaved caspase-3表达、肝细胞凋亡情况、肝组织中Kupffer细胞数及肝组织白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平。

1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 6软件将实验所得数据进行分析。计量资料用±s表示，组与组之间比较采用t检验。大鼠的生存率采用生存(Survival)分析，绘制生存曲线(Survival curve)，采用Kaplan-Meier法比较各组间小鼠生存率。以P＜ 0.05为界限判断是否具有统计学意义。

2 结果 Results

2.1 大环内酯类抗生素对肝移植后大鼠存活率的影响实验观察了大鼠原位肝移植后7 d内的存活率。结果发现，对照组大鼠在肝移植后第5天全部死亡；与对照组比较，大环内酯类抗生素组大鼠肝移植后存活率显著增加(P＜ 0.05)，见图1。

2.2 大环内酯类抗生素对肝移植后大鼠血清肝酶活性的影响ELISA检测肝移植后48，72 h大鼠血清中AST和ALT的活性，结果显示：肝移植后48 h，与对照组相比，大环内酯类抗生素组大鼠的ALT(图2A)和AST(图2C)活性均明显降低(P＜ 0.05)；同样，肝移植后72 h，与对照组相比，大环内酯类抗生素组大鼠的ALT(图2B)和AST(图2D)活性均降低(P＜ 0.01)。

以上结果说明，大环内酯类抗生素改善了移植肝脏的功能失调。

2.3 大环内酯类抗生素对肝移植后大鼠肝组织形态学和再生能力的影响在对照组肝组织显示炎性细胞浸润，同时伴有肝细胞水肿，体积增大，胞浆淡染、疏松化，甚至出现肝细胞气球样变；相对于对照组，大环内酯类抗生素组移植肝组织以上现象明显改善(图3A)。

相对于对照组，大环内酯类抗生素组移植后肝组织的Suzuki评分显著降低(图3C，P＜ 0.01)。

Ki-67的免疫组化结果(图3B)显示，相对于对照组，大环内酯类抗生素组移植后肝组织中Ki-67阳性细胞数显著增加(图3D，P＜ 0.01)。

2.4 大环内酯类抗生素对肝移植后大鼠肝细胞凋亡的影响TUNEL法结果显示，相对于对照组，大环内酯类抗生素组肝组织中TUNEL阳性细胞数量(图4A和B)和cleaved caspase-3/caspase-3比率(图4C和D)均显著降低(P＜ 0.001)。

2.5 大环内酯类抗生素对肝移植后大鼠肝组织中Kupffer细胞表达和炎性细胞因子的影响免疫荧光结果显示，对照组肝组织中有大量的Kupffer细胞浸润，而大环内酯类抗生素组的肝脏显示较少的Kupffer细胞(图5A和B，P＜ 0.001)。

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