大环内酯类抗生素对大鼠肝移植后缺血再灌注损(2)

大环内酯类抗生素如红霉素、克拉霉素和罗红霉素长期以来在临床一直作为抗菌药物使用，不良反应很小。有研究报道，临床使用剂量的红霉素等大环内酯类抗生素预处理可诱导体外缺氧耐受和体内心/脑缺血的耐受[12-13]。并且，红霉素等大环内酯类抗生素在应用于器官移植手术中可减轻炎症反应[14-15]。然而，关于大环内酯类抗生素对原位肝移植中IRI影响的研究尚少见文献报道。因此，该研究中构建自体原位肝移植大鼠模型，探讨大环内酯类抗生素(罗红霉素+克拉霉素+红霉素)对自体原位肝移植中IRI的作用，并对其机制进行初步探讨。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点动物造模、血液标本采集与检测和组织标本采集与制作于2018年12月至2019年1月在海南省人民医院医学实验动物中心完成；组织标本检测于2019年3月至5月在郑州卫生健康职业学院基础医学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 60只七八周龄SPF级雄性Wistar大鼠，体质量240-260 g，购自河南省实验动物中心[SCXK(豫) 2017-0001]。将大鼠饲养在室温(24±1)℃、湿度45%-55%RH、昼夜循环12 h/12 h的SPF级动物饲养室中，可自由获取水和标准实验室食物，适应饲养5 d。

所有动物实验遵从动物福利，实验方案通过实验动物伦理委员会审查。

1.3.2 实验用主要药品和试剂 罗红霉素(roxithromycin，RXM)、克拉霉素(clarithromycin，CAM)和红霉素(erythromycin，EM)均购自美国Sigma公司；丁丙诺啡购自青海制药厂有限公司；UW溶液购自美国Bristol-Myers Squibb公司。

1.4 实验方法

1.4.1 原位肝移植模型构建与分组处理 吸入0.8%-3%异氟烷(Intervet KK，日本)麻醉大鼠。在肝脏采集前静脉注射1 mL含200 U肝素的生理盐水。大鼠随机分为2组，大环内酯类抗生素组和对照组，每组30只。在肝切除前30 min，大环内酯类抗生素组供体大鼠采用大环内酯类抗生素(含60 mg/kg罗红霉素、20 mg/kg克拉霉素和40 mg/kg红霉素)混合液2 mL注入门静脉；对照组供体大鼠门静脉注入生理盐水2 mL。肝切除后，通过门静脉用10 mL冷(4℃)生理盐水冲洗供体肝脏，然后供体肝脏在UW溶液中冷缺血储存18 h。为了类似于人肝移植过程中的热缺血时间，在手术植入开始之前将肝脏维持在21℃无菌环境中15 min。所有肝脏通过门静脉用10 mL盐水溶液重新冲洗并称质量。然后用袖带技术的改进版本进行原位肝移植[16-17]，将两组大鼠置于循环温水垫上，在外科手术过程中将其体温保持在℃的正常范围内。大环内酯类抗生素组大鼠在原位肝移植时立即向门静脉中推注大环内酯类抗生素(含60 mg/kg罗红霉素、20 mg/kg克拉霉素和40 mg/kg红霉素)混合液2 mL；对照组大鼠推注同剂量的生理盐水 2 mL。在手术结束时，切口闭合后立即皮下注射丁丙诺啡0.05 mg/kg。

大鼠恢复意识后，每组随机挑选20只大鼠，用于观察1-7 d生存率。剩余每组10只大鼠在移植后48 h和72 h收集血清，并在72 h时麻醉处死大鼠，收集肝组织。

1.4.2 肝功能生化指标检测 原位肝移植后48，72 h，尾静脉收集血样(n=10)，通过离心获得血清并储存在-20℃直至分析；通过全自动生化分析仪测定天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)活性。

1.4.3 肝脏的组织学分析 移植后72 h的肝组织(n=10)制作石蜡组织，并制作5 μm厚的石蜡切片。肝组织石蜡切片行常规苏木精-伊红染色。每张切片随机选6个视野，采用改良的Suzuki评分标准对6个视野进行评分[18]，评估肝组织IRI的严重程度(充血，空泡化，细胞浸润和坏死)，评分越高，病理改变越重。

1.4.4 肝脏再生检测 用Ki-67免疫组化染色评估移植后 72 h的肝组织(n=10)再生。肝组织石蜡切片行常规脱蜡、复水和抗原修复后，滴加1∶200的Ki-67抗体(#sc-；Santa Cruz，美国)室温孵育1 h，PBS洗涤3次后；滴加 1∶200二抗，室温孵育45 min，PBS洗涤3次后；滴加SABC孵育15 min，PBS洗涤后，滴加DAB显示液孵育5 min，自来水冲洗后；常规脱水和中性树脂封固。显微镜下任选6个视野拍照，通过Image J软件对Ki-67阳性细胞进行计数。

实验动物造模过程的相关问题 造模目的： 观察大环内酯类抗生素预处理对肝移植术后肝缺血再灌注损伤的影响 借鉴已有标准实施动物造模： 参考文献[15-16]进行原位肝移植造模 动物来源及品系： 七八周龄SPF 级雄性Wistar 大鼠，购自河南省实验动物中心[SCXK(豫)2017-0001]模型与所研究疾病的关系： 缺血再灌注损伤影响肝移植的成功率，解决或降低肝缺血再灌注损伤有助于提高肝移植成功率 造模技术描述： 大鼠吸入0.8%-3%异氟烷麻醉，在肝脏采集前静脉注射1 mL 含200 U 肝素的生理盐水。在肝切除前30 min，大环内酯类抗生素组供体大鼠采用大环内酯类抗生素(含60 mg/kg 罗红霉素、20 mg/kg 克拉霉素和40 mg/kg 红霉素)混合液2 mL 注入门静脉；对照组门静脉注入生理盐水2 mL。肝切除后，供体肝脏在UW 溶液中冷缺血储存18 h，在手术开始之前将肝脏维持在21℃无菌环境中15 min，通过门静脉用10 mL 盐水溶液重新冲洗并称重，然后用袖带技术的改进版本进行原位肝移植，术中保持体温在℃。大环内酯类抗生素组大鼠在原位肝移植时立即向门静脉中推注同上大环内酯类抗生素混合液2 mL；对照组推注生理盐水2 mL。在手术结束时，切口闭合后立即皮下注射丁丙诺啡0.05 mg/kg造模主要用药： 大环内酯类抗生素(含60 mg/kg 罗红霉素、20 mg/kg克拉霉素和40 mg/kg 红霉素) 动物数量及分组方法： 60 只雄性Wistar 大鼠，随机分为2组，大环内酯类抗生素组和对照组，每组30 只 造模成功评价指标： 造模后4 h 内大鼠恢复意识 造模后实验观察指标： ①1-7 d 生存率；②术后48，72 h 血清天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶活性；③术后72 h 肝组织形态、肝组织Ki-67和cleaved caspase-3 表达肝细胞凋亡情况、肝组织中Kupffer 细胞数及肝组织白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α 水平 造模过程中动物死亡原因： 术中无动物死亡，术后死亡是实验观察的指标之一、

文章来源：《电力系统保护与控制》 网址: http://www.dlxtbhykzzz.cn/qikandaodu/2021/0501/858.html